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以下是植物脂氧合酶(LOX)ELISA試劑盒的實驗使用說明,綜合了相關(guān)檢測原理、操作步驟及注意事項:
BS-8002 植物脂氧合酶(LOX)ELISA試劑盒
檢測原理?
采用雙抗體夾心法:
微孔板預(yù)包被LOX抗體形成固相抗體
依次加入樣本、HRP標(biāo)記的檢測抗體,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物
TMB顯色后,顏色深淺與LOX活性呈正相關(guān),450nm測OD值計算濃度
試劑盒組成?
預(yù)包被微孔板
標(biāo)準(zhǔn)品(通常含S0-S5濃度梯度)
HRP標(biāo)記抗體、TMB顯色液、終止液
濃縮洗滌液(需1:20稀釋)
樣本處理?
組織樣本?:按1:5~10(質(zhì)量:體積)加入提取液,冰浴勻漿后4℃ 15000g離心20min取上清
保存要求?:分裝后-20℃凍存,避免反復(fù)凍融;NaN3會抑制HRP活性,需避免使用
操作步驟?
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?:按說明書梯度稀釋(如0-320 U/L)
加樣?:
分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本各50μL至對應(yīng)孔
立即加入50μL HRP標(biāo)記抗體,37℃孵育60min
洗滌?:手工洗板需加滿洗滌液,靜置1min后甩干,重復(fù)5次
顯色?:
每孔加TMB底物100μL,37℃避光顯色15-30min
加終止液50μL,顏色由藍(lán)變黃
檢測?:450nm測OD值,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度
注意事項?
試劑使用前需室溫平衡20分鐘,結(jié)晶需水浴溶解
顯色時間需嚴(yán)格控制,避免過度反應(yīng)
空白孔(S0)作為陰性對照,樣本OD值需在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)
結(jié)果計算?
樣本濃度=標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)濃度×稀釋倍數(shù)(若樣本預(yù)先稀釋需乘以相應(yīng)系數(shù))
如需具體試劑盒的差異步驟,請參考對應(yīng)產(chǎn)品的說明書。
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