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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟
更新時(shí)間:2019-08-30瀏覽:4344次

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  熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟:

 ?、偃龃嬉蚜呀獾募?xì)胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。

 ?、趦上喾蛛x 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

 ?、跼NA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

 ?、躌NA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7000rpm離心5分鐘。

  ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

  ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定

  先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。

  ① 濃度測定

  A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計(jì)算如下:

  RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495μl的TE中,測得A260 = 0.21

  RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

  取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 μl,剩余RNA總量為:

  35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

 ?、诩兌葯z測

  RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。

  2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

  ①制膠

  1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

  灌制凝膠板,預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內(nèi),加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

 ?、跍?zhǔn)備RNA樣品

  取3μgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

 ?、垭娪?/p>

  上樣前凝膠須預(yù)電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。

 ?、茏贤馔干涔庀掠^察并拍照

  28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。 ①反應(yīng)體系 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

  ②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。

  ③取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR

 ?、?beta;-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。

 ?、诜磻?yīng)體系如下:

  標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

  管家基因反應(yīng)體系: 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

 ?、壑苽浜玫年栃詷?biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時(shí)上機(jī),反應(yīng)條件為:93℃2分鐘,然后93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個(gè)循環(huán)。 ①針對(duì)每一需要測量的基因,選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

  反應(yīng)體系: 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

  35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

  ②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

 ?、蹖CR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。 ①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

  體系配置如下: 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

 ?、趯⑴渲坪玫腜CR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃2分鐘預(yù)變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個(gè)循環(huán),后72℃7分鐘延伸。 各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

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